Desde o início, Catarina estava totalmente preparada para contestar o desejo de Henrique VIII, de anular seu matrimônio. Ela não estava, de forma alguma, disposta a acatar tranquilamente tal decisão. Como católica devota, ela acreditava que seu casamento era um ato sagrado, e não deveria ser banalizado da maneira que seu marido estava fazendo. Tampouco estava disposta a lutar apenas por seu casamento, ela lutaria também por sua filha, Maria, uma vez que a anulação poderia, de algum modo, prejudicar seu futuro.

Catarina estava totalmente convencida de que seu casamento com Henrique era legal, e sabia que as tentativas dele em provar que seu irmão Arthur havia consumado seu curto casamento com ela, eram uma farsa. Ela acreditava na dispensa Papal, que provava que seu casamento com Henrique era válido e legal, já que (para um católico) havia sido sancionada pela mais alta autoridade religiosa na Terra. A rainha manteve uma resistência muito ativa contra a anulação – para a surpresa de Henrique, que esperou que ela, de modo passivo, acatasse a situação.

Não haviam dúvidas sobre o porquê Catarina desempenhou tal papel. Ela era uma mulher forte, católica devota, e acreditava na santidade do matrimônio, porém, também acreditava que havia sido uma boa esposa para seu marido, e que havia cumprido com todos os seus deveres como rainha, sendo sempre fiel e discreta. Por justiça natural, Catarina não tinha dúvidas que deveria continuar desempenhando este papel.

Ela escreveu uma série de cartas ao Papa Clemente VII e a seu sobrinho Carlos V, Sacro Imperador Romano, explicando sua posição e pedindo que eles a apoiassem. Ela possuía o apoio de muitos para essa causa, tanto na Inglaterra, como em toda a Europa. Catarina também fez um apelo pessoal para Henrique, em 1529; ela ficou de joelhos implorando-lhe para não seguir com a anulação. Testemunhas oculares afirmaram que Henrique ficou perplexo com o que ela havia feito. Ao deixar a sala onde estava o Rei, ela foi ordenada a retornar, porém, não o fez. Mais tarde foi dito que, como uma rainha e esposa leal, ela censurou-se por suas próprias ações, e pelo modo no qual havia desobedecido Henrique. Catarina disse a seus conselheiros que nunca antes havia desobedecido a seu marido, e que se arrependeu ao fazê-lo em 1529. No entanto, nas cartas que secretamente trocou com sua filha, Maria, durante seu período de exílio, Catarina  dizia a jovem para que respeitasse seu pai, mas acima de tudo, que se mantivesse firme diante de suas convicções, a fim de salvar sua alma.

Apesar de suas objeções a uma anulação, Catarina nunca disse ou escreveu nada nada abertamente crítico a Henrique, em 1529-1533. Quando um dos representantes de Carlos V (Eustace Chapuys) tentou convencê-la de que sua popularidade era tal, que uma rebelião bem sucedida contra Henrique poderia ser organizada, ela disse que nada teria a ver com isto. Na verdade, ela escreveu a Carlos, o instruindo a ignorar o conselho de Chapuys.

Após uma anulação forçada, Henrique ordenou que Catarina tivesse o título de Princesa Viúva de Gales. Ela nunca acatou tal decisão, e morreu intitulando-se Catarina a Rainha.